产品组分

储存条件

长期保存，请置于-20℃，有效期24个月。

产品简介

XK High Fidelity DNA 聚合酶是一种高保真的热稳定DNA聚合酶，可用于快速高保真PCR扩增。本产品包含高纯度XK High Fidelity DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应的增强剂、优化剂以及稳定剂，浓度为2×。在镁离子存在的条件下，该酶可催化三磷酸脱氧核苷酸沿 5'→3’方向发生聚合反应，合成DNA。它还具有校正功能的3’→5’外切酶活性。XK High Fidelity DNA聚合酶比普通Taq酶扩增效率高、错配率低（其保真度约相当于普通Taq DNA Polymerase的60倍以上、Pfu DNA Polymerase的6倍），同时具有更快的DNA合成速度（15-30sec/kb）和更强的扩增能力。本产品扩增得到的产物为平末端，3’ 端没有突出的“A”碱基，胶回收后可与TOPO-TA载体（XKL0602或者XKL0606）连接。

适用范围

1) 高保真PCR快速扩增

2) 复杂模板的DNA扩增

3）长距离PCR

4）血液直接PCR扩增

配制体系

2.高复杂基因组模板，50 μl反应体系中，DNA 模板的使用量应该在100-500 ng，如果扩增的片段较长，最好用琼脂糖电泳检测DNA的完整性。DNA的完整性越好，长距离PCR的成功率越高。

3.cDNA模板的添加量不要超过PCR反应体系的1/10，50 μl PCR反应体系中RT产物的加入量为2-3μl，不要超过5μl。

推荐程序

1. XK High Fidelity DNA 聚合酶具有很高的热稳定性，可以用98℃预变性，对于大多数模板而言，98℃预变性1 min就足够了，预变性不要超出3 min。当然也可以按照常规方法使用94℃变性2-5 min。血液直接扩增时，预变性可设置95℃ 10 min，让细胞裂解并释放DNA。

2. 在循环扩增时，98℃变性持续时间可以设定5-10sec，简单模板5sec，复杂模板10sec。

3. 一般条件下，可以采用如上表所列的三温度梯度循环的PCR扩增方法，引物的退火温度为两条引物中较低Tm-5，引物的退火持续时间可以设定10-20 sec。当两条引物的Tm值都大于等于70℃时，而且都使用了长引物，可以使用两步法来扩增，两步法中退火温度和延伸温度都为72℃。

4. XK High Fidelity DNA聚合酶的最佳延伸温度是72℃。延伸所需要的时间依赖于扩增产物的长度和复杂度。对于质粒，BAC这类简单模板，可以使用15 sec/kb延伸速度，对于高复杂性的基因组DNA，可以使用30sec/kb延伸速度。扩增1kb以下的产物时，延伸时间不要超过40 sec。

常见问题与解决办法

Q1：扩增无产物或产物量少？

A1：

1) 模板降解或模板纯度差。电泳检测模板质量，使用高质量模板；

2) 模板浓度过低。适当增加模板用量；

3) 引物不合适。优化引物设计；

4) 退火温度不合适。设置退火温度梯度，摸索合适的退火温度；

5) 循环数过少。适当增加5~10个循环；

6) 延伸时间不足。在粗提物做模板或者模板具有复杂序列的情况下，把延伸速度改成30-60 sec./kb。

Q2：扩增出现非特异条带或弥散带？

A2：

1) 引物特异性差。优化引物，避免非特异性条带以及引物二聚体的扩增；

2) 引物浓度过高。降低引物浓度；

3) 模板过量或纯度差。减少模板量，使用高质量模板；

4) 退火温度过低。适当提高退火温度或使用Touchdown PCR程序；

5) 循环数过多。减少循环数至25~30 cycles。